谷(Gu)氨(An)酸(Suan)脱(Tuo)氢(Qing)酶(Mei)（(?)Glutamate Dehydrogenase）(?)的(De)活(Huo)性(Xing)检(Jian)测(Ce)方(Fang)法(Fa)

1. 目(Mu)的(De)

本(Ben)程(Cheng)序(Xu)是(Shi)为(Wei)了(Liao)建(Jian)立(Li)谷(Gu)氨(An)酸(Suan)脱(Tuo)氢(Qing)酶(Mei)（(?)Glutamate Dehydrogenase）(?)的(De)活(Huo)性(Xing)检(Jian)测(Ce)方(Fang)法(Fa)，(?)适(Shi)用(Yong)于(Yu)GLDH成(Cheng)品(Pin)的(De)活(Huo)性(Xing)检(Jian)测(Ce)。(?)

2. 范(Fan)围(Wei)

  适(Shi)用(Yong)于(Yu)GLDH成(Cheng)品(Pin)、(?)半(Ban)成(Cheng)品(Pin)及(Ji)其(Qi)他(Ta)样(Yang)品(Pin)的(De)检(Jian)测(Ce)。(?)

4. 定(Ding)义(Yi)

   U: 在(Zai)pH7.3, 37度(Du)的(De)环(Huan)境(Jing)下(Xia), 每(Mei)分(Fen)钟(Zhong)转(Zhuan)化(Hua)1umolα-酮(Tong)戊(Wu)二(?)酸(Suan)变(Bian)成(Cheng)L-谷(Gu)氨(An)酸(Suan)所(Suo)需(Xu)要(Yao)的(De)酶(Mei)量(Liang)。(?)

   活(Huo)性(Xing): 每(Mei)毫(Hao)升(Sheng)样(Yang)品(Pin)中(Zhong)的(De)活(Huo)性(Xing)值(Zhi)。(?)

   比(Bi)活(Huo): 每(Mei)毫(Hao)克(Ke)蛋(Dan)白(Bai)的(De)活(Huo)性(Xing)值(Zhi)。(?)

5. 内(Nei)容(Rong)

5.1原(Yuan)理(Li)

α-Ketoglutarate + NH₃ + NADH + H⁺        L-Glutamate+ NAD⁺ +H₂O

NADH的(De)消(Xiao)耗(Hao)可(Ke)以(Yi)通(Tong)过(Guo)340nm的(De)光(Guang)吸(Xi)收(Shou)进(Jin)行(Xing)检(Jian)测(Ce)。(?)

5.2试(Shi)剂(Ji)：(?)

A  0.1 M Tris-HCl 缓(Huan)冲(Chong)液(Ye), pH 8.3

B  1.5M NH₄Cl溶(Rong)液(Ye)

C  0.225M α-酮(Tong)戊(Wu)二(?)酸(Suan)溶(Rong)液(Ye)(pH 7.0-9.0)

D  7.5mM NADH溶(Rong)液(Ye)

E   酶(Mei)稀(Xi)释(Shi)液(Ye): 0.1 M Tris-HCl 缓(Huan)冲(Chong)液(Ye), pH 8.3

试(Shi)剂(Ji)的(De)配(Pei)制(Zhi)方(Fang)法(Fa)详(Xiang)见(Jian)各(Ge)试(Shi)剂(Ji)配(Pei)制(Zhi)记(Ji)录(Lu),配(Pei)制(Zhi)人(Ren)员(Yuan)需(Xu)完(Wan)整(Zheng)填(Tian)写(Xie)配(Pei)制(Zhi)记(Ji)录(Lu)。(?)

5.3 操(Cao)作(Zuo)规(Gui)程(Cheng)：(?)

5.3.1仪(Yi)器(Qi)参(Can)数(Shu)设(She)定(Ding)

若(Ruo)仪(Yi)器(Qi)中(Zhong)无(Wu)已(Yi)保(Bao)存(Cun)参(Can)数(Shu)，(?)按(An)以(Yi)下(Xia)参(Can)数(Shu)设(She)定(Ding)。(?)若(Ruo)已(Yi)有(You)相(Xiang)关(Guan)参(Can)数(Shu)，(?)调(Diao)取(Qu)后(Hou)确(Que)认(Ren)。(?)

检(Jian)测(Ce)方(Fang)法(Fa)：(?)动(Dong)力(Li)学(Xue)扫(Sao)描(Miao)

测(Ce)量(Liang)波(Bo)长(Chang)：(?)340nm         测(Ce)量(Liang)时(Shi)间(Jian)：(?)180s

延(Yan)迟(Chi)时(Shi)间(Jian)：(?)60s            积(Ji)分(Fen)时(Shi)间(Jian)：(?)120s

系(Xi)数(Shu)/因(Yin)子(Zi)：(?)6.776          测(Ce)量(Liang)温(Wen)度(Du)：(?)30±1℃(?)

5.3.2 样(Yang)品(Pin)准(Zhun)备(Bei)

若(Ruo)待(Dai)测(Ce)样(Yang)品(Pin)为(Wei)固(Gu)体(Ti)，(?)可(Ke)以(Yi)按(An)10mg 样(Yang)品(Pin)/1000ul 超(Chao)纯(Chun)水(Shui)比(Bi)例(Li)溶(Rong)解(Jie)。(?)溶(Rong)解(Jie)后(Hou)于(Yu)2-8度(Du)放(Fang)置(Zhi)30min。(?)

5.3.3 检(Jian)测(Ce)方(Fang)法(Fa)

5.3.3.1 在(Zai)石(Shi)英(Ying)比(Bi)色(Se)皿(Min)中(Zhong)加(Jia)入(Ru)2.5ml 试(Shi)剂(Ji)A, 200ul试(Shi)剂(Ji)B,100ul 试(Shi)剂(Ji)C, 100ul D于(Yu)30度(Du)孵(Fu)育(Yu)2min。(?)

5.3.3.2 加(Jia)入(Ru)50ul 样(Yang)品(Pin)后(Hou), 温(Wen)和(He)混(Hun)匀(Yun)后(Hou)开(Kai)始(Shi)测(Ce)定(Ding)。(?)

5.3.3.3 测(Ce)定(Ding)结(Jie)束(Shu)后(Hou)，(?)记(Ji)录(Lu)相(Xiang)应(Ying)数(Shu)值(Zhi)：(?)起(Qi)始(Shi)读(Du)数(Shu)、(?)△(?)A/min test、(?)活(Huo)性(Xing)值(Zhi)（(?)U/ml）(?)。(?)

5.3.3.4 活(Huo)性(Xing)值(Zhi)（(?)U/ml）(?)范(Fan)围(Wei)为(Wei)0.1-0.3U/ml，(?)若(Ruo)超(Chao)出(Chu)范(Fan)围(Wei)，(?)待(Dai)测(Ce)样(Yang)品(Pin)需(Xu)经(Jing)试(Shi)剂(Ji)D稀(Xi)释(Shi)后(Hou)再(Zai)次(Ci)进(Jin)行(Xing)检(Jian)测(Ce)。(?)

5.3.3.5测(Ce)定(Ding)样(Yang)品(Pin)前(Qian)需(Xu)检(Jian)测(Ce)空(Kong)白(Bai)反(Fan)应(Ying)值(Zhi)，(?)即(Ji)其(Qi)他(Ta)操(Cao)作(Zuo)不(Bu)变(Bian)，(?)用(Yong)500ul E代(Dai)替(Ti)样(Yang)品(Pin)加(Jia)入(Ru)比(Bi)色(Se)皿(Min)后(Hou)进(Jin)行(Xing)反(Fan)应(Ying),测(Ce)定(Ding)△(?)A/min blank。(?)

5.3.3.6计(Ji)算(Suan)公(Gong)式(Shi)  活(Huo)性(Xing)(U/ml) =(△(?)A/min test-△(?)A/min blank)×6.776×df （(?)稀(Xi)释(Shi)倍(Bei)数(Shu)）(?)

5.4 成(Cheng)品(Pin)检(Jian)测(Ce)结(Jie)果(Guo)精(Jing)密(Mi)度(Du)要(Yao)求(Qiu)：(?)每(Mei)个(Ge)样(Yang)品(Pin)检(Jian)测(Ce)时(Shi)，(?)在(Zai)线(Xian)性(Xing)范(Fan)围(Wei)内(Nei)选(Xuan)择(Ze)三(San)个(Ge)不(Bu)同(Tong)的(De)稀(Xi)释(Shi)度(Du)进(Jin)行(Xing)测(Ce)定(Ding)，(?)得(De)到(Dao)的(De)原(Yuan)液(Ye)/粉(Fen)末(Mo)活(Huo)性(Xing),计(Ji)算(Suan)Cv值(Zhi),Cv值(Zhi)得(De)要(Yao)求(Qiu)为(Wei)<5%,达(Da)到(Dao)要(Yao)求(Qiu)后(Hou),此(Ci)次(Ci)测(Ce)定(Ding)的(De)结(Jie)果(Guo)认(Ren)为(Wei)有(You)效(Xiao), 取(Qu)三(San)个(Ge)检(Jian)测(Ce)数(Shu)值(Zhi)的(De)平(Ping)均(Jun)数(Shu)作(Zuo)为(Wei)最(Zui)终(Zhong)的(De)检(Jian)测(Ce)数(Shu)值(Zhi)。(?)若(Ruo)不(Bu)能(Neng)达(Da)到(Dao),对(Dui)此(Ci)三(San)个(Ge)稀(Xi)释(Shi)应(Ying)进(Jin)行(Xing)重(Zhong)新(Xin)检(Jian)测(Ce)。(?)

此(Ci)方(Fang)法(Fa)仅(Jin)作(Zuo)为(Wei)参(Can)考(Kao)！(?)